4生物传感器详解

发布时间:2021-10-20 11:01:20

发酵过程控制
(Control of Fermentation Process) 第四章 生物传感器

第四章 生物传感器
4.1 概述 4.2 生物传感器基本原理 4.3 酶传感器 4.4 微生物传感器 4.5 其他生物传感器

什么是传感器?
某工艺参数 传感器 电、热、光 变换器 电信号转换器数字量

传感器三要素:
(1)直接触被测物;

(2)可传递性;
(3)输出信号与被测参数有明确的关系,最好是线 性关系。

4.1 概述 4.1.1 什么是生物传感器
组成:生物传感器 固定化生物材料——具有专一性功能 (感受器) 转换器——具有传递性功能 功能:被测物质浓度→生物传感器→可传递信号→数字量

生物传感器的发展历程:
? 酶法分析——具有高度专一性,但操作复杂、时 间长。 ? 固定化酶——使酶法分析自动化,但不具备传递 性,只能取样检测。 ? 电极——具传递性,但不具备专一性。

氧电极

pH电极

生物传感器的发展历程:

酶法分析 ? 固定化酶? ?生物传感器 电极 ?

4.1.2 生物传感器的特点
(1)特异性好:能从复杂的系统中准确测出某一物 质的浓度。
(2)灵敏度高:可检测0.1~1.0ppm浓度的物质, 最小极限为10-10g/mL。 (3)稳定性相对较差:检测结果易受物理和化学环 境因素的影响。

(4)不能加热杀菌处理:其中的生物物质有失活的 可能,因此一般不能加热杀菌处理。
(5)制作工艺精细,废品率高,成本昂贵。

4.1.3 生物传感器的分类

感受器 生物传感器 转换器

(1)根据生物物质分类(感受器)
酶传感器 微生物传感器 细胞器传感器 组织传感器 各种酶 微生物细胞 细胞膜、线粒体、电子传递体、微 粒体等细胞器 细胞组织

免疫传感器
基因(DNA)传感器

抗原、抗体
核酸(DNA、RNA)

(2)根据转换器分类
生物物质发出的信号
信号转换器 电极式
转换器

可传递信号

生物反应产生的信号 各种电极活性物质,如O2、CO2、H+、 NH4+等

热敏电阻式
光电纤维式 半导体式 压电晶体式


光 电场 气体

等离子体共振式 磁场

4.1.4 应用领域与前景 4.1.4.1生物传感器的应用领域
(1)在酵工业方面:主要是各种酶传感器和 微生物传感器 如:糖、甲醇、乙醇、醋酸、甲酸、谷氨酸、 赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、抗生物质、 氨、甲烷、BOD及菌体数等生物传感器 。

(2)环境检测方面:应用较多的是各种微生 物传感器 如:BOD、NH3、NOX、SOX、甲烷及各 种重金属离子等BOD、NH3、NOX、SOX、 甲烷及各种重金属离子等。 (3)医疗方面:主要是酶传感器、免疫传感 器、基因传感器 如:血清检查和尿样检查等。 (4)食品分析:主要是各种酶传感器、免疫 传感器

4.2 生物传感器的原理
4.2.1电极式生物传感器原理
电极式生物传感的组成:
?固定化生物催化剂膜? ? ? 识别被测物质的功能 电极式生物传感器 ? ?电极 ? ? ? 转换器的功能

被 测 物 质

生物催化剂

酶 、微生物 抗体、抗原 细胞器、细胞组织

电 极
电极活性物质电化学反应

输出电信号



电极式生物传感器原理示意图

电极式生物传感器原理模式:
被测物质 固定化生物催化剂膜 电极活性物质 电 极 电信号 生物化学反应
电化学反应

4.2.2电极活性物质
? 电极活性物质——指易于在电极上反应的物质, 如:O2、CO2、H2O2、H+、NH3等 。例如:
被测物质 生物催化剂膜 乳酸 乳酸氧化酶膜 电极活性物质
(反应生成或消耗物质)

电极
氧电极(电流↓) CO2 电极(电压↑)

消耗O2

L-赖氨酸 L-赖氨酸脱羧酶膜 生成CO2

4.2.3电极的转换方式
★电流法——电极活性物质在电极上反应产生电流。

常用电极有:氧电极、H2O2电极、燃料电池型电极 等。
★电压法——电极活性物质有选择地感应产生膜电压。 常用电极有:离子选择电极、氨电极、CO2电极等。

4.2.4其它生物传感器原理
被测物质固定化生物催化剂膜 热
生物化学反应
热敏电阻

电信号

被测物质固定化生物催化剂膜 光
生物化学反应 其他信号:电场 电场

光计数器

电信号

磁场

4.3 酶传感器
△酶传感器是应用固定酶膜作为识别被测物 质敏感元件(感受器)的生物传感器。 △酶传感器包括酶电极传感器、酶光纤传感 器和酶热敏电阻传感器等。 △Clack最初提出了使用酶进行电化学测定的 原理。 △希克斯(Hicks)和厄迪克(Updick) 首先 研制成了测定葡萄糖的酶传感器。

4.3.1 酶反应与转换器的耦联
? 耦联关系是指酶反应所生成(如:H2O2、 CO2等)或消耗(如O2等)的某种物质, 能被转换器转换成电信号。

酶传感器中转换器与酶反应的耦联关系
酶 例 氧化酶、过氧 化氢酶等 脱氢酶 耦联物质 O2 H2O2 NADH 转换器 氧电极 H2O2电极 燃料电极 转换器输出信号 电流 电流 电流

尿酶、酰氨酶
尿酶、脱氨酶 脱羧酶
脂肪酶、青霉素酶

NH4+ (酸性)
NH3(碱性) CO2 H+

铵电极
氨电极 CO2电极 玻璃电极

电压
电压 电压 电压

4.3.2 固定化酶膜(EBM)的制备 (1)固定化方法
? 包埋法:活性损失最小,但不适于测量大分子底物; ? 共价法、交联法:活性损失较大,适应性较广。

(2)酶膜制备
?包埋法? 酶 ? ? ?膜状 ? ? ? EBM ? ? ? ?共价法? ? 固定化酶? 载体? ? ?颗粒等其它状? 用透析膜包容? EBM ? ?交联法?

酶膜制备实例:
? 将乙醇氧化酶和聚乙烯亚胺及牛血清蛋白溶液混 合起来,加入5%(V)戊二醛溶液,在5℃下, 存放4小时。 ? 这种酶的混合物包在聚碳酸脂膜(孔径0.03μm) 和醋酸纤维素膜之间,并在5℃使其风干24h。 ? 用0.02%(V)戊二醛溶液处理,并用磷酸盐缓冲 液洗涤,即制得乙醇氧化酶膜(厚度约20μm)。

(3)酶膜的性质
?包埋法 ? ? ? 响应时间较长 ①响应特性: ? ?共价法 ? 交联法 ? ? ? 响应时间较短

② 使用寿命:与使用环境条件(温度、pH 等)有关,一般为一个月左右。

4.3.3 酶传感器实例
例1:葡萄糖传感器:
①传感器组成:
葡萄糖氧化酶 聚丙烯酰胺凝胶 包埋法 葡萄糖氧化酶膜 氧电极

葡萄糖传感器

葡萄糖传感器示意图
空气 电解质溶液 Pb
聚四氟乙稀膜

记录仪

被 测 溶 液

Pt

固定化葡萄糖氧化酶膜

空气

电解质溶液 Pb

记录仪

例1:葡萄糖传感器: ②电极反应:
在酶膜上:

聚四氟乙稀膜

被 测 溶 液

Pt

固定化葡萄糖氧化酶 膜

C6H12O6 + O2 葡萄糖氧化酶 C6H10O6 + H2 O2
葡萄糖 葡萄糖酸

在氧电极上:

在Pb阳极:Pb→Pb2++2e

在Pt阴极:1/2O2+H2O+2e→2OHˉ

③测定原理:
葡萄糖 酶催化反应 电极旁O2浓度↓电化学反应 电流值↓→葡萄糖浓度
酶膜上 氧电极上

④主要性能 测量范围:1~500 mg/L 响应时间:10~30 s 使用寿命:60~100 day

氧化酶膜与过氧化氢电极组成葡萄糖传感器:

葡萄糖氧化酶膜 ? ?葡萄糖传感器 H 2 O 2 电极 ?

例2:乙醇传感器:
①传感器组成:将固定化乙醇氧化酶膜用圆形 橡胶环装在过氧化氢电极的表面,即组成乙醇 传感器。

乙醇氧化酶膜? ?乙醇传感器 H 2 O 2 电极 ?

②电极反应:
酶膜上的反应:
乙醇氧化酶 C2H5OH? O2 ? H2O ? ?? ??CH3CHO? H2O2

乙醇

乙醛

电极上的反应:
在Pt阳极上:H2O2→2H++O2+2e 在Ag阴极上:1/2O2+2H++2e→H2O

③测定原理
乙醇 酶催化反应 生成H2O2 电化学反应 电流值↑→推算乙醇浓度
乙醇氧化酶膜 H2O2电极

④电极主要性能
A.测量范围:0~30%(V); B.相对误差:2%; C.响应时间:20S; D.使用寿命:半衰期30天左右。

某些酶传感器一览表
待测物 质 固定化酶 转换器

测量范围 响应时间 稳定性 (mg/L) (min) (day)
15(S) 10(S) 5 30 (S) 40 20(S) 60~100 100 14 14 >14 30

铂电(H2O2) 1~5×103 葡萄糖 葡萄氧化酶 氧电极(O2) 1~5×102 100~5000 各种糖 蔗糖酶、变旋酶 氧电极(O2) 葡萄糖氧化酶 燃料电极(NADH) ~1000 乳酸 乳酸脱氢酶 乙醇 乙醇脱氢酶 乙醇氧化酶 原电池
铂电极(H2O2)

<4600 0~30%(V)

尿素

尿酶

青霉素 青霉素酶 L-酪氨酸 酪氨酸脱羧酶

铵电极(NH4+) 氨电极(NH3) 玻璃电极(H+) CO2电极(CO2)

10~1000 10~1000 10~1000 10~104

0.5~1 2~4 0.5~2 1~2

21 30 7~14 20

4.4 微生物传感器
? 在酶传感器制造中,首先遇到的困难就是酶的提 取与精制。
微生物 ? 固定于高分子膜上? 固定化微生物膜 ? ?微生物传感器 转换器?

微生物膜作为分子识别元件利用:

①利用微生物细胞内单一或多个酶的机能——类似于酶传感器; ②利用微生物的生理机能。

4.4.1 微生物传感器的原理与分类

? 酶活性测定型——以微生物酶催化反应的 活性为指标;(类似于酶传感器) ? 呼吸活性测定型——以微生物呼吸活性为 指标; ? 电极活性物质测定型——以微生物代谢产 物为指标。

(1)呼吸活性测定型——必须是好气性微生物


微生物利用 的被测物质

好 气 微 生 物 膜

氧浓度↓

氧电极

电流值↓

CO2生成

CO2电极

电位值↑

(2)电极活性物质测定型——包括厌氧和好氧微生物
固 定 化 微 生 物 膜

CO2
H2 NH3

CO2电极

电位式
电流式

铂阳极,Ag2O2阴极 氨电极 电位式

待测物质

H+

玻璃电极

电位式
电流式

还原型辅酶

燃料电极

4.4.2 微生物传感器特点
(1)微生物较酶易获得,价格相对较低; (2)稳定性好,连续使用时间可达一个月左右;

(3)响应时间比酶传感器长,多数在10分钟左右;
(4)特异性较酶传感器差。

4.4.3 微生物传感器实例
例1:谷氨酸传感器 谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸的反应为:
HOOC-(CH2)2-CHNH2-COOH
谷氨酸脱羧酶

HOOC-(CH2)2-CH2NH2 + CO2

具有较高谷氨酸脱羧酶 活性的微生物膜 ? ?测定谷氨酸传感器 CO 2 电极?

(1)传感器制备
大肠杆菌细胞


冷冻干燥


用水调匀


涂布于尼龙网(60目,ф7mm)两面 ↓

CO2 电 极

电极膜(硅橡胶膜)

细胞尼龙网(大肠杆菌)
赛璐酚膜

置于CO2电极上


外用赛璐酚膜盖住


谷氨酸传感器

(2)测定原理
?无谷氨酸 ? 不产生 CO 2 在无氧条件下 ? ?有谷氨酸 ? CO 2 ?? CO 2 电极电位 ?? 推算谷氨酸含量

(3)主要性能 A.响应时间:5min左右; B.测量范围:10~800mg/L; C.使用寿命:20day。

(4)专一性: A.对谷氨酰胺有响应,对其它氨基酸 的作用可忽略。 B.葡萄糖<7.9g/L、醋酸<0.2g/L时, 无影响。 C.无机离子影响可忽略。

例2:氨传感器
(1)测定原理 硝化菌氧化铵的反应要消耗氧: NH4+ + O2 硝酸菌 NO2―

NO2― + O2 硝化细菌 NO3―
NH4+ 微生物反应 电极旁O2浓度↓电化学反应 电流值↓→推算NH4+浓度
硝化菌膜上 氧电极上

(2)传感器制备
活性污泥 ↓分离 硝化菌
氧 电 极 Pt
乙酸纤维素膜 ( 硝化菌 )


固定于乙酸纤维素膜 ↓ 安装于氧电极上 ↓ 测定铵(氨)微生物传感器

透气膜
聚四氟乙烯膜

(3)主要特性 ? 响应时间:2min(pH=10的缓冲溶液中) ? 测量范围:1~42 mg/L ? 相对误差:<4% ? 使用时间:20day

某些微生物传感器一览表
待测物质 葡萄糖 乙醇 醋酸 甲酸 微生物膜 P. flourescens T. brassicae T. Brassicae C. butyricum E. Coli Sarcina flave E. coli B. Cacaveris 电极 氧电极 氧电极 氧电极 铂阳极、 Ag2O2阴极 CO2电极 NH3电极 CO2电极 NH3电极 pH电极 测定范围 响应时间 (min) (mg/L ) 5~20 5~30 10~100 1~300 10~800 20~1000 10~200 0.5~90 100~500 10 10 10 30 5 5 5 5 10 稳定性 (day) >14 30 20 30 20 14 14 10 7

谷氨酸
赖氨酸 天冬氨酸

头孢菌素 Citrobacter fenundi

4.5其他生物传感器
4.5.1免疫电极传感器
? 免疫电极(immuno bioelectrode)是以免疫物质 (抗原或抗体)作为敏感元件的电化学生物传感 器。 ? 免疫物质的高特异性识别使免疫电极具有很高的 特异性。 ? 根据测定过程是否需要标记物可分为直接免疫电 极(direct immuno electrode)和间接免疫电极 (indirect immuno electrode)。

(1)直接免疫电极——不用任何标记物
例如(设抗体为被测物):
?介电常数变化 ? ?电导率变化 电极 ? 固定化抗原膜 电信号(电压) 膜电位变化 ? 离子通透性变化 膜电压变化 电化学或电学变化 ? ? ? ?离子淌度变化

抗体

???? ??

??? ?

特点:不需额外试剂,仪器要求简单,操作容易,响应快; 缺点:灵敏度低,因而难以作为标准检测方法

(2)间接免疫电极 ——需要制备酶标抗体或酶标抗原结合物 ▲利用标记物将免疫反应的信号放大后间接 测定抗原或抗体,这类电极称为间接免疫 电极,亦称酶联免疫测定法或ELISA法 (enzyme linked immunoassay)。

例如(设抗体为被测物):
抗体 ↓固定化酶标抗原膜 抗体与酶标抗原结合 ↓ 改变酶标抗原存在状态 ↓固定化酶标抗原膜←底物 状态改变的酶标抗原催化底物反应 ↓ 反应速度与试样中抗体浓度有关 ↓ 推测试样中抗体浓度

4.5.2 DNA传感器
? DNA测定主要指靶DNA的检测、DNA序列测定和 DNA杂交测定。 ? DNA测定在分子生物学及其基因操作研究、临床 诊断、反恐侦检、食品安全、检疫等方面应用广 泛。 ? 传统的DNA检测主要依靠膜上分子杂交和电泳, 其特点是技术要求高,时间长、成本高、效率低。

? *年来DNA传感器和DNA列阵的出现,使DNA的 检测大大减化。

(1)DNA传感器的特点
①特异性好。 ②稳定性好—离体DNA比蛋白质(酶)分子稳定。

③制备简单,DNA可用仪器批量合成。
④DNA的操作方法具有通用性,容易标准化。

⑤结合芯片技术,可制备DNA列阵,实现高通量测定。
⑥灵敏度高,可以达到10-11mol/L以上。 ⑦用途极其广泛。

(2)DNA传感器的分类
★按转换器的不同可分为电极型(电化学型)、光学型和质 量型等。其中应用最广泛的电极型DNA传感器,根据其作 用原理的不同可分为五大类: A. 直接DNA电化学型(direct DNA electrochemistry) B. 间接DNA电化学型(indirect DNA electrochemistry) C. 特异性氧化还原指示剂型(specific redox indicator) D. DNA介导的带电输出型(DNA-mediated charge transport) E. 纳米颗粒电化学放大型(nanoparticles electrochemical enhancing)

(3)DNA电化学传感器原理
? DNA电化学传感器通常由已知序列的单链DNA (ssDNA,通常称为探针)分子和电极组成。
样品中互补的ssDNA 固定化ssDNA dsDNA 电极表面 电信号变化
杂交反应

结构变化 电化学反应

识别和测定靶基因

*题与思考题
1. 简述生物传感器的组成、特点和分类。 2. 举例说明酶传感器的原理。 3. 简述微生物传感器、免疫传感器和基因传 感器的原理。 4. 酶传感器、微生物传感器的工艺设计,包 括传感器组成、电极反应、及测定原理。

谢谢大家!


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